玛丽于1515年11月22日在洛林巴勒迪克出生，是吉斯家族首领吉斯公爵克洛德·德·洛林和安托瓦内特·德·波旁的长女。她的母亲是旺多姆伯爵弗朗索瓦·德·波旁和卢森堡的玛丽的女儿。在她的11个兄弟姐妹中，有吉斯公爵弗朗索瓦·德·洛林、欧马勒公爵克洛德·德·洛林、洛林枢机主教夏尔·德·洛林和吉斯枢机主教路易一世·德·洛林。玛丽个子高，她的母亲在一封信中提到玛丽患有重感冒。不过，有这样一个传说：安托瓦内特·德·波旁在前往玛丽的“所谓的”出生地的途中，在一个平民的家中生下了玛丽。

玛丽5岁时成为了妹妹路易丝·德·洛林的教母。不久以后，玛丽跟着祖母格德司的菲利帕在蓬塔穆松的贫穷修女会修道院生活。当玛丽大约14岁时，她的伯父洛林公爵安托万·德·洛林和伯母勒妮·德·波旁来到此地拜访她的祖母菲利帕。玛丽的品德和身材给公爵夫妇留下了深刻印象，他们把玛丽从修道院带走，準备让她在法国宫廷生活。1531年，玛丽在法国国王弗朗索瓦一世和奥地利的莱昂诺尔的婚礼上首次亮相。她与国王的女儿马德莱娜·德·瓦卢瓦（她后来成为了苏格兰国王詹姆斯五世的第一任妻子）和玛格丽特·德·瓦卢瓦建立了友谊。

1534年8月4日，18岁的玛丽与朗格维尔公爵路易二世·德·奥尔良在卢浮城堡结婚。他们的婚姻很幸福，但也很短暂。1535年10月30日，玛丽生下了她的第一个儿子弗朗索瓦·德·奥尔良，但路易却于1537年6月9日在鲁昂去世，21岁的玛丽成为了寡妇。在她的余生中，玛丽一直保留着她的好丈夫和好朋友路易的最后一封信，信中提到了路易的病情，并解释了他在鲁昂逗留的原因。如今，依旧能在苏格兰国家图书馆内看到这封信。1537年8月4日，玛丽生下了他们的第二个儿子，她以亡夫的名字将这个遗腹子命名为路易。路易早夭，但弗朗索瓦依旧给在苏格兰的母亲写信。1545年3月22日，弗朗索瓦给母亲送去了一根绳子，以显示他有多高，1546年7月2日，他又给玛丽送去了他的肖像画。

1537年，詹姆斯五世的第一任妻子马德莱娜·德·瓦卢瓦因肺结核去世，为了再续老同盟，詹姆斯想要再娶一位法国新娘，后来，玛丽成为了婚姻谈判的焦点。据一位17世纪的作家说，当詹姆斯五世前往法国与马德莱娜·德·瓦卢瓦和玛丽·德·波旁会面时就被玛丽吸引，并将她视为心目中妻子的第二人选。众所周知，玛丽参加了詹姆斯和马德莱娜的婚礼。不久前才丧偶的英格兰国王亨利八世也向玛丽求婚，试图阻止苏格兰和法国联姻。考虑到亨利的婚姻史（驱逐原配凯瑟琳，斩首第二任妻子安妮·博林），玛丽拒绝了他的求婚。1537年12月，亨利八世对法国驻伦敦大使卡斯蒂永说，他本人身材高大，需要一个高大的妻子。传记作家安东妮亚·弗雷泽于1969年写道：“玛丽回覆说，‘我可能是个身材高大的女人，但我的脖子很细。’”这句着名的令人毛骨悚然的俏皮话显然是在说亨利八世的第二任妻子——受过法国教育的安妮·博林，安妮·博林曾在死前开玩笑说刽子手会发现杀死她很容易，因为她有“一个细脖子”。

法国国王弗朗索瓦一世接受了詹姆斯的求婚，并向玛丽的父亲转达了他的意愿。弗朗索瓦準备了一份婚姻契约，并为玛丽提供了和法国血亲公主一样多的嫁妆。玛丽的母亲发现这份契约极其古怪，因为国王把玛丽儿子的遗产也算进了嫁妆内。玛丽接到这个讯息时既震惊又惊恐，因为她不想离开家人和国家，尤其是她刚刚失去了第一任丈夫和小儿子。据说，玛丽的父亲试图拖延时间，直到詹姆斯可能察觉出了她的不情愿，他给玛丽写信，恳求能得到她的忠告和支持。然而，这封于1935年首次出版的信的真实性受到了质疑。大卫·比顿前往法国参加婚姻谈判。1537年10月22日，他从里昂给詹姆斯五世写信说，玛丽“身体健康，脸色红润，经得住长途跋涉。”比顿还写道吉斯公爵“非常渴望这次旅行，事情草草收场”，他已经和他的哥哥洛林公爵商量过了，玛丽本人则和母亲呆在尚帕涅等待谈判的结果。

玛丽与詹姆斯的婚姻契约于1538年1月签订，按照惯例，如果国王先离世，身为王太后的玛丽将终身拥有福克兰宫、斯特林城堡、丁沃尔城堡和特利维城堡的产权，以及相应领地的租金收入。最终，玛丽接受了这场婚事，并为行程制定了仓促的计画。1538年5月9日，玛丽与詹姆斯五世的代理婚礼在沙托丹城堡的圣徒礼拜堂举行。詹姆斯五世派了大约2000名勋爵和男爵从苏格兰搭乘由麦克斯韦勋爵率领的船队前往法国参加代理婚礼。麦克斯韦勋爵本人是詹姆斯的代理人。麦克斯韦勋爵和前来法国的贵族们与玛丽一起返回苏格兰。玛丽于1538年6月10日从勒阿弗尔启航，6日后在法夫的克雷尔登入苏格兰。几日后，詹姆斯在为欢迎她而举行的盛装游行和演出中正式接待了玛丽。1538年6月，当22岁的玛丽离开法国时，她被迫把3岁的儿子弗朗索瓦留在法国。自从他的父亲路易二世·奥尔良去世后，年幼的弗朗索瓦成为了新任朗格维尔公爵。

1538年6月18日，詹姆斯和玛丽亲自在圣安德鲁斯教堂结婚。詹姆斯的母亲玛格丽特·都铎在7月写给亨利八世的信中说：“我相信她会证明自己是一位聪明的公主。我经常和她作伴，她对我很尊敬，非常讨人喜欢。”吉斯公爵给她派去了几名石匠和矿工，以及一名军械製造师，她还让法国画家帮她装饰宫殿。1540年2月22日，玛丽在荷里路德修道院加冕为苏格兰王后。玛丽从1539年10月开始为加冕仪式做準备，当时，珠宝商约翰·莫斯曼製作了一顶新王冠，并将玛丽的银质节杖镀成金色。为了向玛丽致敬，爱丁堡城堡的大卫塔发射了30支礼炮，还有由詹姆斯设计、由王家炮兵队士兵製作的烟花表演。

玛丽和詹姆斯育有两个儿子：罗斯西公爵詹姆斯（1540年5月22日生于圣安德鲁斯）和奥尔巴尼公爵罗伯特（1541年4月12日出生并接受洗礼），但两人都在1541年4月21日去世，当时，詹姆斯将近一岁，罗伯特只有八天大。玛丽的母亲安托瓦内特·德·波旁写道，这对夫妇还年轻，应该有希望生育更多的孩子。她认为更换乳母和餵食过盛可能无益于孩子存活。玛丽与詹姆斯的第三个孩子也是最后一个孩子于1542年12月8日出生，是个女孩，名为玛丽·斯图亚特。六日后，詹姆斯国王离世，使还在襁褓中的玛丽成为了苏格兰女王。

起初，第二代阿伦伯爵詹姆斯·汉密尔顿以摄政王的身份接管了苏格兰政府。英格兰国王亨利八世希望玛丽·斯图亚特能嫁给他的儿子爱德华王子（即后来的英格兰国王爱德华六世）。苏格兰国内因此产生矛盾，这些人更倾向于与法国结盟，结果导致英格兰入侵，即所谓的“粗暴求婚（Rough Wooing）”。玛丽·德·吉斯告诉英格兰外交官拉尔夫·萨德勒，摄政王阿伦伯爵是一个“没心没肺的人”，她可以很容易地发现他的“全部意图”。1543年4月，阿伦伯爵听到一个传言，说亨利八世现在想迎娶玛丽·德·吉斯作为他的第六任妻子。阿伦伯爵就此事与玛丽·德·吉斯当面对质，玛丽·德·吉斯闪烁其词，从他那里得知（她已经猜到了），他把一切都告诉了萨德勒。随后，玛丽·德·吉斯派心腹第三代弗莱明勋爵马尔科姆·弗莱明向萨德勒汇报这次谈话的内容。

起初，玛丽不情愿地呆在林利斯哥宫，随后，她于1543年7月和年幼的女王一起移居斯特灵城堡。当拉尔夫·萨德勒于8月再次和玛丽谈话时，玛丽向他保证，当玛丽·斯图亚特10岁时，与英格兰王室的联姻会继续进行下去。在此期间，玛丽·斯图亚特在斯特灵城堡内平平安安，玛丽·德·吉斯说她很高兴能呆在斯特灵，并且“她对那里的房子讚不绝口”。亨利八世很快就清楚地了解到，即便有苏格兰方面的承诺和《格林威治条约》的签订，玛丽·斯图亚特和爱德华王子依旧不会结婚。1543年底，亨利八世发动了一场现在被称为“粗暴求婚”的战争，希望能扭转局面。1544年，玛丽首当其冲想取代阿伦伯爵成为摄政王，但未成功。

1547年9月，苏格兰在小沟谷战役（Battle of Pinkie Cleugh）中战败后，法国的军事援助削弱了英格兰的决心，增强了玛丽的权力基础。1548年7月，玛丽前去察看哈丁顿围攻战（Siege of Haddington）的战况。玛丽一行人出现在英格兰枪手的射击範围内，在她周围，有16名随从被杀。根据苏格兰议会在哈丁顿做出的决议，年幼的玛丽·斯图亚特于1548年8月被送往法国，与法国国王亨利二世的儿子，她的未婚夫，法国王太子弗朗索瓦一起抚养长大。玛丽最初计画与女儿一起从邓巴顿启航，直到船只抵达她的朝圣地惠特霍恩，但她最后还是回到爱丁堡参加了一场政务会会议。

就在这时，《The Complaynt of Scotland》的献词回忆说玛丽·德·吉斯是布永的戈弗雷的后裔，并称她的勇气和美德远在古代女英雄托米丽司、塞米勒米斯和彭忒西勒亚之上。1549年圣诞节，玛丽·德·吉斯在斯特灵城堡谈判，为围攻布劳迪城堡争取更多的法国枪枝，之后，她于1550年2月在泰河对岸更加谨慎地观看了这次成功的袭击。1549年9月，英国军队放弃了对哈丁顿的占领，保罗·德·泰尔姆和阿伦伯爵进驻该城。得意洋洋的玛丽·德·吉斯写道：“英格兰人只留下了瘟疫。”和平进程开始了，英格兰与法国于1550年3月24日签订了《布洛涅条约》。作为条约的一部分，玛丽·德·吉斯的弟弟马耶讷侯爵克洛德·德·洛林成为了被派往英格兰的六名法国人质之一。条约签署后，玛丽·德·吉斯得以去法国看望家人。

玛丽于1550年9月6日离开苏格兰，準时抵达迪耶普，并于1550年10月1日与女儿一起参加了法国宫廷在鲁昂举行的会演。在鲁昂，玛丽和苏格兰女王在列队中骑马跟在举着条幅的士兵后面，条幅上描述了法国在不久前保卫并夺回了苏格兰要塞。玛丽带来了一大批苏格兰贵族。整个冬天，玛丽都呆在布卢瓦的法国宫廷内，然后和亨利二世一起度过了夏天，参观了都尔、昂热和南特。4月，玛丽在昂布瓦斯得知有人要密谋毒杀苏格兰女王，大为震惊。5月，在伦敦发现的潜在投毒者，苏格兰人罗伯特·斯图亚特被送往法国。在法国的这段时间内，玛丽急于为女儿与王太子的婚事缔结最好的婚姻契约，并为自己谋取财政支持。5月，玛丽一行人在都尔逗留期间，一位愤世嫉俗的英格兰观察家约翰·梅森仔细端详了这群来自苏格兰的随行人员，他汇报说：“苏格兰王太后让整个宫廷都对她感到厌烦，她真是一个纠缠不休的乞丐。国王只得摆脱她。”

玛丽的儿子弗朗索瓦在陪同母亲返回迪耶普时在亚眠去世。1551年10月，玛丽在英格兰与爱德华六世会面。玛丽在朴茨茅斯登入，并在索斯威克修道院度过了第一个夜晚。在前往伦敦的路上，玛丽在沃灵顿、考德雷、汉普敦宫和富勒姆宫逗留。爱德华六世在怀特霍尔宫与玛丽见面时将一枚原本属于凯瑟琳·帕尔的钻石戒指送给了她。玛丽·都铎（即后来的英格兰女王玛丽一世）拒绝接待到访的玛丽，不过，伊莉莎白·都铎（即后来的英格兰女王伊莉莎白一世）却在场，根据约翰·艾尔默的说法，与爱德华宫廷内的其他女性不同，她并未试图仿效玛丽的苏格兰随从，梳与众不同的法式髮型。