由于原子核所含有的中子数不同，具有相同质子数的原子具有不同的质量，这些原子被称为同位素。例如，碳的3个主要同位素分别为12C、13C和14C，它们都有6个质子和六个电子，但中子数则分别为6、7和8。与质子相比，含有太多或太少中子均会导致同位素的不稳定性，如14C。这些不稳定的“放射性同位素”将会衰变成稳定同位素。而12C和13C则因为质子和中子所特有的稳定结合，不发生衰变，即为稳定同位素。

在生态学和环境科学研究中最常用的是碳、氮、硫、氧和氢的稳定同位素，这些稳定性同位素可以通过气体同位素比率质谱分析法测得。首先将样品转化成气体（如CO2，N2，SO2或H2），在离子源中将气体分子离子化（从每个分子中剥离一个电子，导致每个分子带有一个正电荷），接着将离子化气体打入飞行管中。飞行管是弯曲的，磁铁置于其上方，带电分子依质量不同而分离，含有重同位素的分子弯曲程度小于含轻同位素的分子。在飞行管的末端有一个法拉第收集器，用以测量经过磁体分离之后，具有特定质量的离子束强度。

以CO2为例，需要有三个法拉第收集器来收集质量分别为44、45和46的离子束。不同质量离子同时收集，从而可以精确测定不同质量离子之间的比率。

图 CO2的三个最常见质量——44（C,O,O）、45（C,O,O）和46（C,O,O）在质谱仪飞行管中的分布图。进入飞行管的CO2在通过离子源时，每个分子都被剥离一个电子，形成带正电的离子。

在飞行管中，磁场导致离子发生偏离，偏离半径与离子的质量/电荷比率成比例。重离子比轻离子偏离小（偏离半径大）。以CO2为例，质量为46的离子偏离半径最大，质量为44的离子偏离半径最小，质量为45的离子则介于两者之间。电荷也会影响偏离半径，但对于绝大多数分子而言，由于离子源仅剥离一个电子，因此，离子电荷数基本是恆定的。

稳定同位素丰度表示为样品中两种含量最多同位素比率与国际标準中回响比率之间的比值，用符号（δ）表示。由于样品与标準参照物之间比率差异较小，所以稳定同位素丰度表示为样品与标準之间偏差的千分数。以碳为例：

δC样品 = {(C/C样品) / (C/C 标準) - 1} x 1000

标準物质的稳定同位素丰度被定义为0‰。以碳为例，国际标準物质为Pee Dee Belemnite，一种碳酸盐物质，其普遍公认的同位素绝对比率（C/C）为0.0112372。如果某种物质的C/C比率>0.0112372，则具有正值；若其13C/12C比率<0.0112372，则具有负值。下表列出了5种环境稳定同位素的国际标準及其绝对同位素比率。氧和氢等稳定同位素具有多个国际标準。